一．服務(wù)內(nèi)容
我公司提供的單細胞建庫測序技術(shù)服務(wù)是針對大規(guī)模細胞群體進行表達譜分析，具體服務(wù)內(nèi)容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術(shù)對細胞懸液樣本中的500~10,000個單細胞進行捕獲標記，同時對每個標記了的細胞中的RNA分子進行獨立標記，建成用于illumina測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。建成的文庫將在illumina NGS測序平臺上進行測序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對測序的結(jié)果進行解碼，并針對單個細胞的表達譜差異對樣本細胞群進行細胞亞群分析。
二．實驗操作步驟概述
1. 對單細胞懸浮液樣本進行10x Genomics上機，制備油包水微滴乳濁液（GEMS）。
2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀，進行逆轉(zhuǎn)錄操作。
3. 破乳后進行cDNA的回收、純化和擴增等操作。
4. 進行片段化，末端修復(fù)，加A、加接頭，Sample Index PCR等后續(xù)文庫構(gòu)建操作。
三．實驗結(jié)果
我公司完成10x Genomics建庫技術(shù)服務(wù)的過程中提供2個結(jié)果，分別是文庫質(zhì)檢結(jié)果報告和測序結(jié)果分析報告。
四．樣品要求及注意事項
1. 接收的樣品為單細胞懸液，如需組織解離，細胞分選等樣品制備需由客戶自行完成。
2. 單細胞懸液中，細胞間無粘連，無大于40uM的細胞碎片或其他顆粒物），單細胞懸液上樣前需過40uM細胞濾網(wǎng)（如Falcon cell strainer, REF 352340），確保不會堵塞微流控通道。
3. 細胞懸液中單細胞個數(shù)應(yīng)大于預(yù)期實測細胞個數(shù)的2倍，如預(yù)期測到500個單細胞的數(shù)據(jù)，應(yīng)提供至少1000個單細胞。
4. 細胞成活率應(yīng)大于85%（用臺盼藍染色檢測）。
5. 上機單細胞懸液體積應(yīng)小于30ul，建議細胞懸液濃度大約為1000個細胞/ul。
6. 如一次性上機多個樣品，第一個樣品制備完成到最后一個樣品制備完成時間相差不超過1個小時。
五．服務(wù)驗收標準
在細胞樣品達到上述要求的前提下，結(jié)果達到如下標準：
1.測序文庫合格：文庫檢測為單峰，且濃度高于3nM，體積大于25ul。
2.細胞捕獲效率達到50%：最終測序數(shù)據(jù)結(jié)果中的細胞數(shù)達到50%的起始細胞數(shù)。
六．服務(wù)承諾
1. 對于達到樣本要求的實驗，由于細胞計數(shù)誤差等實驗中存在的不確定性，實驗結(jié)果在上述標準的±20%以內(nèi)都為可以接受的范圍。如果結(jié)果在驗收標準20%以下的（即捕獲效率低于40%）可判定實驗失敗，公司將承擔(dān)該樣本的試劑耗材及服務(wù)費等全部費用。
2. 如果實驗過程中確認試劑耗材質(zhì)量的問題，我公司負責(zé)向10x Genomics廠家申請賠付。（通過其它渠道采購的試劑耗材，我們也將協(xié)助客戶完成索賠）
3. 如果細胞樣品未達到要求，客戶可以選擇重新送樣或風(fēng)險上機，風(fēng)險上機將不能按照上述標準驗收。
七．常見問題解答
1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標準是65%，為什么貴公司承諾只有50%？
答：廠家測試捕獲效率用的是細胞系，細胞系樣品很容易制備成單細胞懸液，且能保證較高的細胞活性和完整性，而服務(wù)項目客戶很少用細胞系，大部分是用組織解離制備的細胞懸液，其細胞成活率相對較低，而且細胞計數(shù)的方法也會給結(jié)果造成一定偏差，因此我們把標準定在50%。
2. 建好的文庫送給測序公司上機前，文庫質(zhì)檢達不到測序公司的合格標準怎么辦？
答：測序公司出于免責(zé)的考慮，對客戶自建的文庫質(zhì)檢標準會比較嚴格，因此有可能我們庫檢沒問題的樣品測序公司會判定為不合格。請把測序公司的文庫質(zhì)檢結(jié)果發(fā)送劉元和牛松，我們根據(jù)質(zhì)檢結(jié)果判定是否應(yīng)承擔(dān)測序上機風(fēng)險。
3. 如果實驗失敗了，貴公司如何賠償？
答：兩種情況，一是如果因10x芯片或試劑導(dǎo)致實驗失敗，我們負責(zé)聯(lián)系廠家索賠，服務(wù)項目就更換試劑耗材重新做實驗。二是客戶細胞樣品合格、非風(fēng)險上機情況下建庫失敗，就不收取費用。實驗過程中的問題，我們和客戶應(yīng)本著互信原則協(xié)商解決，實驗失敗我們不對客戶細胞樣品進行賠償。
4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進行的標準分析外，貴公司還能提供哪些分析？
答： 基本分析
⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉(zhuǎn)化為fastq，生成后期的樣本index序列文件，UMI序列及MRNA序列。
⑵ 序列比對注釋 將序列比對到相應(yīng)的參考基因組的基因區(qū)域。
⑶ 按照細胞和基因組信息統(tǒng)計UMI，barcode信息，計算細胞和基因表達矩陣。
其他高級分析
⑴ t-SNE降維分析及聚類：利用T分布隨機相鄰嵌入法(t-SNE)對數(shù)據(jù)降維處理，基于2維數(shù)據(jù)展示。利用聚類算法對細胞進行聚類分析，聚類后的細胞群體之間進行差異表達分析。
⑵ 基因的富集分析：差異基因進行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。
