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單細胞測序

一.服務(wù)內(nèi)容


我公司提供的單細胞建庫測序技術(shù)服務(wù)是針對大規(guī)模細胞群體進行表達譜分析,具體服務(wù)內(nèi)容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術(shù)對細胞懸液樣本中的500~10,000個單細胞進行捕獲標記,同時對每個標記了的細胞中的RNA分子進行獨立標記,建成用于illumina測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。建成的文庫將在illumina NGS測序平臺上進行測序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對測序的結(jié)果進行解碼,并針對單個細胞的表達譜差異對樣本細胞群進行細胞亞群分析。

 

二.實驗操作步驟概述


1. 對單細胞懸浮液樣本進行10x Genomics上機,制備油包水微滴乳濁液(GEMS)。

2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀,進行逆轉(zhuǎn)錄操作。

3. 破乳后進行cDNA的回收、純化和擴增等操作。

4. 進行片段化,末端修復(fù),加A、加接頭,Sample Index PCR等后續(xù)文庫構(gòu)建操作。

 

三.實驗結(jié)果


我公司完成10x Genomics建庫技術(shù)服務(wù)的過程中提供2個結(jié)果,分別是文庫質(zhì)檢結(jié)果報告和測序結(jié)果分析報告。

 

四.樣品要求及注意事項


1. 接收的樣品為單細胞懸液,如需組織解離,細胞分選等樣品制備需由客戶自行完成。

2. 單細胞懸液中,細胞間無粘連,無大于40uM的細胞碎片或其他顆粒物),單細胞懸液上樣前需過40uM細胞濾網(wǎng)(如Falcon cell strainer, REF 352340),確保不會堵塞微流控通道。

3. 細胞懸液中單細胞個數(shù)應(yīng)大于預(yù)期實測細胞個數(shù)的2倍,如預(yù)期測到500個單細胞的數(shù)據(jù),應(yīng)提供至少1000個單細胞。

4. 細胞成活率應(yīng)大于85%(用臺盼藍染色檢測)。

5. 上機單細胞懸液體積應(yīng)小于30ul,建議細胞懸液濃度大約為1000個細胞/ul。

6. 如一次性上機多個樣品,第一個樣品制備完成到最后一個樣品制備完成時間相差不超過1個小時。

 

五.服務(wù)驗收標準


在細胞樣品達到上述要求的前提下,結(jié)果達到如下標準:

1.測序文庫合格:文庫檢測為單峰,且濃度高于3nM,體積大于25ul。

2.細胞捕獲效率達到50%:最終測序數(shù)據(jù)結(jié)果中的細胞數(shù)達到50%的起始細胞數(shù)。

 

六.服務(wù)承諾


1. 對于達到樣本要求的實驗,由于細胞計數(shù)誤差等實驗中存在的不確定性,實驗結(jié)果在上述標準的±20%以內(nèi)都為可以接受的范圍。如果結(jié)果在驗收標準20%以下的(即捕獲效率低于40%)可判定實驗失敗,公司將承擔(dān)該樣本的試劑耗材及服務(wù)費等全部費用。

2. 如果實驗過程中確認試劑耗材質(zhì)量的問題,我公司負責(zé)向10x Genomics廠家申請賠付。(通過其它渠道采購的試劑耗材,我們也將協(xié)助客戶完成索賠)

3. 如果細胞樣品未達到要求,客戶可以選擇重新送樣或風(fēng)險上機,風(fēng)險上機將不能按照上述標準驗收。

 

七.常見問題解答


1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標準是65%,為什么貴公司承諾只有50%?

答:廠家測試捕獲效率用的是細胞系,細胞系樣品很容易制備成單細胞懸液,且能保證較高的細胞活性和完整性,而服務(wù)項目客戶很少用細胞系,大部分是用組織解離制備的細胞懸液,其細胞成活率相對較低,而且細胞計數(shù)的方法也會給結(jié)果造成一定偏差,因此我們把標準定在50%。

 

2. 建好的文庫送給測序公司上機前,文庫質(zhì)檢達不到測序公司的合格標準怎么辦?

答:測序公司出于免責(zé)的考慮,對客戶自建的文庫質(zhì)檢標準會比較嚴格,因此有可能我們庫檢沒問題的樣品測序公司會判定為不合格。請把測序公司的文庫質(zhì)檢結(jié)果發(fā)送劉元和牛松,我們根據(jù)質(zhì)檢結(jié)果判定是否應(yīng)承擔(dān)測序上機風(fēng)險。

 

3. 如果實驗失敗了,貴公司如何賠償?

答:兩種情況,一是如果因10x芯片或試劑導(dǎo)致實驗失敗,我們負責(zé)聯(lián)系廠家索賠,服務(wù)項目就更換試劑耗材重新做實驗。二是客戶細胞樣品合格、非風(fēng)險上機情況下建庫失敗,就不收取費用。實驗過程中的問題,我們和客戶應(yīng)本著互信原則協(xié)商解決,實驗失敗我們不對客戶細胞樣品進行賠償。


4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進行的標準分析外,貴公司還能提供哪些分析?

答: 基本分析 

 ⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉(zhuǎn)化為fastq,生成后期的樣本index序列文件,UMI序列及MRNA序列。

 ⑵ 序列比對注釋 將序列比對到相應(yīng)的參考基因組的基因區(qū)域。

 ⑶ 按照細胞和基因組信息統(tǒng)計UMI,barcode信息,計算細胞和基因表達矩陣。

   其他高級分析

 ⑴ t-SNE降維分析及聚類:利用T分布隨機相鄰嵌入法(t-SNE)對數(shù)據(jù)降維處理,基于2維數(shù)據(jù)展示。利用聚類算法對細胞進行聚類分析,聚類后的細胞群體之間進行差異表達分析。

 ⑵ 基因的富集分析:差異基因進行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。